缺血后适应对肢体缺血-再灌注后心肌损伤的影响

所属分类：医学论文  日期：2018-08-29  浏览：次

 

 

何平    河北港口集团港口医院     

张梅    河北秦皇岛市妇幼保健院

 

 

摘要：目的： 观察大鼠肢体缺血-再灌注（LIR）后心肌的变化及缺血后适应对心肌的影响，探讨缺血后适应对肢体缺血再灌注后心肌的保护作用。方法：采用目前我科室常规方法复制大鼠LIR 模型。把实验动物随机分为三组：1.正常对照组（Control）：橡皮带松绕大鼠双后肢根部；2.缺血再灌注组（IR）：结扎大鼠双后肢根部，缺血4小时再灌注2小时；3.缺血后适应组（IPC）：结扎大鼠双后肢根部，缺血4小时后，在再灌注前分别给予反复缺血3min，间隔3min，共三次后恢复血流灌注2小时。观察血浆丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶（SOD）、黄嘌呤氧化酶（XOD）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同功酶（CK-MB）、天门冬酸氨基转移酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）和α－羟丁酸脱氢酶（HBDH）含量的变化，测定心肌组织MDA、SOD、XOD和髓过氧化物酶（MPO）含量；HE 染色光镜下观察心肌组织的形态学改变。结果：与Control组相比，肢体缺血再灌注后大鼠血浆和心肌组织中MDA和XOD含量增加，SOD水平下降，血浆心肌酶学指标CK、CK-MB、AST、LDH及HBDH含量均可见明显增加，心肌组织MPO活性增加，光镜下可见Control组心肌纤维排列整齐，横纹清晰，染色均匀，IR组局部心肌纤维断裂，呈波浪状改变，横纹紊乱。IPC组与IR组比较，血浆和心肌组织MDA和XOD含量下降，抗氧化酶SOD活性升高，各项心肌酶学指标均有不同程度下降，心肌组织MPO活性降低，光镜下心肌组织的病理性改变减轻，但仍有少量炎性细胞浸润。结论：缺血后适应可以减轻肢体缺血再灌注后的心肌损伤，对机体具有一定的保护作用。其机制可能与减少自由基生成酶活性、增加自由基清除酶活性、减轻脂质过氧化反应和炎症反应有关。

 

关键词：缺血后适应   再灌注损伤  心肌  肢体  氧化应激

 

 

ABSTRACT：Objective: To observe changes of myocardial tissue after limb ischemic-reperfusion in rats and the influence of ischemic postconditioning on myocardial tissue. Inquire into the protection of myocardial tissue generated by limb ischemic postconditioning.Methods：

The routine method used by the staff in our department  was adopted to make the LIR model rats.Rats were randomized into 3 groups：1.Control group：use the rubber belt to round loosely  big rats’ double hind legs root ；2.IR group（IR）：Ligature big rats’ double hind legs root, lack blood for 4 hours and infuse again to note for 2 hours；3.IPC group（IPC）. Ligature big rats’ double the hind legs root ,after lacking blood for 4 hours,give respectively before infusing again and noting the iteration lack the blood 3 mins, the spacing interval 3 mins, total three times after restore a blood to infuse to note for 2 hours. Observe the contents change of blood plasma MDA、SOD、XOD、CK、CK-MB、AST、LDH和HBDH.Measure the myocardial tissue MDA, SOD, XOD and MPO contents；The HE dyes optics scope down observe the appearance of myocardial tissue .Results:

Compare with Control set，after limb ischemic-reperfusion, MDA and XOD contents raise in big rat blood plasma and myocardial tissue.The SOD contents descends，blood plasma myocardial enzyme CK、CK-MB、AST、LDH and HBDH all obviously raise，the myocardial tissue MPO activity increase，through Optics scope we see in control group myocardial fiber ranking tidy，the horizontal line is clear，dye blance，in IR group the partial myocardial fiber splits，present a wave-like in shape changes，horizontal line mess. IPC group and IR group compare,MDA and XOD contents descend in Blood plasma and myocardial organizen，the SOD activity of anti-oxidation enzyme heats up，each myocardial enzyme index descends to some different degree，The myocardial tissue MPO activity step down.Optics scope display the pathologic changes of myocardial organization eases，but still have a little amount inflammatory cells.In IR group, optics scope display the myocardial organization structure hurts and inflammatory cells infiltration is not more obivious than in IR. Conclusions: Ischemic-postconditioning can ease the myocardial hurts after ischemic reperfusion and have certain protective effect. The mechanism is related to reduce free radical generation enzyme activity, increase radical scavenging enzyme activity and reduce lipid peroxidation and inflammatory responses.

Key words: ischemia postconditioning; reperfusion injury; myocardial; limbs; oxidatie stress

 

肢体缺血再灌注损伤是临床上一种常见的病理过程，如断肢再植、四肢大血管栓塞的解除或损伤修复、严重的肢体挤压伤及肢体手术长时间应用止血带等回复血流灌注后。上述情况不仅缺血组织可出现严重损伤，而且可以进一步导致远隔多器官损伤。心脏及其与之相连的血管，是保证机体内各组织器官正常结构和功能代谢的结构基础，对于机体生命体征的维持至关重要。本研究室以前的研究表明，肢体缺血再灌注可致心肌损伤，预处理可减轻这种继发的心肌损伤，但这种心肌损伤的确切机制及切实可行的保护措施尚不十分清楚。

自1986年Murry等首次提出缺血预适应的保护作用后，这一现象在活体动物和离细胞模型上都得到了证实，而且具有普遍性，它存在于不同种属的多种组织官中。但由于它需要在缺血前实施，而实际临床工作中很难预测到急性缺血事件发生，因此它的临床应用受到限制。

随着对缺血再灌注损伤机制的不断研究，2003年，zhao等提出后适应概念，即：在再灌注即刻给予一次或多次短暂重复心肌缺血/再灌注，能提高心肌对之前发生的较长时间缺血的耐性^[1]。2005年Faraz等研究表明，心肌再灌注前给予肾缺血/再灌注能降低心肌梗死面积，减少再灌注心肌组织肌酸激酶含量，从而保护心脏^[2]。

已有大量研究通过干预PI3K-AKT、p70S6K、ERK1/2、蛋白激酶等细外信号调节通路、线粒体通透性转换孔道及钾通道的通透性、以及用挥发性的卤化麻醉剂等不同药物来研究药理性后适应的保护作用。但关于如何激发和利用机体自身保护机制的研究相对较少。近年来，缺血后适应因为其安全性和操作性方面的优势，逐渐成为研究的热点。

   本试验在LIR 的基础上，观察缺血后适应对肢体缺血再灌注所致心肌损伤的影响，并探讨其可能机制。

 

 

                       材料与方法

 

1材料

1.1标本

    健康雄性Wistar 大鼠，体重(210-260)g，由本院动物中心提供（购自河南医科大学动物中心）。自由进食、饮水，自然光照，室温（26±2）℃，分笼常规喂养。

1.2仪器设备

  哺乳类动物急性手术器械         病理生理学教研室自备

  橡皮带及硬质塑料管             病理生理学教研室自备

  81.2 型磁力恒温搅拌器          上海县曹行无线电元件厂

  Motic 数码医学图象分析系统     北京航空航天大学

  HANGPING FA-2004 电子天平      上海天平仪器厂

  FSH-Ⅱ高速电动匀浆器           江苏金坛金城国胜实验仪器厂

  80-2 离心沉淀器                上海手术器械厂

  光学显微镜                     Olympus,Japan

  721 分光光度计                 上海第三分析仪器厂

  SZ-93 自动双重纯水蒸馏器       上海亚荣生化仪器厂

  JN-A 型精密扭力天平            上海第二天平仪器厂

  SIGMA-2M/ETM 低温高速离心机           美国

  Metler AE240 分析天平                 瑞士

  Scotsman AF30 制冰机                  英国

  Agilent 8453 紫外分光光度计           瑞士

  DYY-Ⅲ-12B 型三恒多用电泳仪        北京市六一仪器厂

  HH.W21Cr600 电热恒温水浴箱         北京长安科学仪器厂

  7150 型全自动生化分析仪               日本

1.3试剂

MDA试剂盒                  南京建成生物制品公司

XOD试剂盒                  南京建成生物制品公司

SOD试剂盒                  南京建成生物制品公司

MPO试剂盒                  南京建成生物制品公司

苏木素                     北京中山生物试剂公司

2方法

2.1动物分组：

     动物随机分为三组，每组10例。（1）缺血再灌注组（ischemia/ reperfusion，IR组）：按模型操作。（2）对照组（Control组）：橡皮带松弛环绕肢体，不阻断血流，其余操作同IR组。（3）缺血后适应组（Ischemia postconditioning，IPC组）：动物于再灌注前，反复缺血3min,再灌注3min,重复3次后恢复血流灌注2h，其余操作同IR组。

2.2模型制备及标本采集:

Wistar 大鼠试验开始前需禁食12 小时，允许自由饮水。采用我科室常规方法^[2]复制大鼠LIR 模型，即：经乙醚浅麻醉下，用适度松紧的橡皮带环绕结扎大鼠双后肢根部以阻断血流4 小时，松解橡皮带再恢复血流灌注2小时。各组动物在再灌注2小时时穿刺腹主动脉取血并提取组织标本，血液经3500 转/分离心15 分钟，所得血浆标本分装在干净的Eppendorf 管中，-70℃保存备用。同时立即开胸取出心脏，迅速纵向剖开左心室，冷PBS 溶液充分冲洗，用滤纸吸干表面水分，液氮速冻，-70℃储藏备用。此外，每组随机取五份新鲜心脏标本，于心尖部位横断面切取组织块（长约0.5cm）迅速投入10%甲醛溶液中固定，次日更换固定液，石蜡包埋后备用。

2.3观测指标：

  （1） 血浆CK、CK-MB、AST、LDH、HBDH

   (2)  血浆SOD、XOD和MDA。

（3） 心肌组织MDA、XOD、SOD、MPO

  （4） 心肌组织HE 染色光镜观察

2.4各指标测定：

2.4.1 生化指标测定步骤：

2.4.1.1 10%心肌组织匀浆的制备：

    应用扭力天平称取已冻存的心肌组织200 mg，在蜡板上用眼科剪将其细细剪碎，移入装有2ml 冷生理盐水的匀浆管中，冰浴条件下电动匀浆3 分钟。匀浆液经3500 转/分离心15 分钟后，收集上清液，测定所需要的心肌组织各项生化指标。

2.4.1.2 血浆肌酸激酶（CK）的测定：（N-乙酰半胱氨酸法）

  使用日本7150 型全自动生化分析仪进行。

（1） 原理：CK 催化以下反应                      

 磷酸肌酸 + ADP      CK         肌酸 + ATP

 

ATP + 葡萄糖        HK       葡萄糖-6-磷酸 + ADP

 

葡萄糖-6-磷酸+ NADPH⁺    G6PDH    6-磷酸-葡萄糖+NADPH+ H⁺

（2）操作步骤：

      取适量血清，以蒸馏水作1：9 稀释作为待测样本。将试剂1 和试剂2 以4：1 的比例配制成一定量的混合试剂,预先保温至37℃。取混合试剂1 ml、稀释后血清0.04 ml，将二者充分混合。在3 分钟后测定其初吸光度值并且开始计时。分别在1 分钟、2 分钟和3 分钟时测其吸光度值，在线性实验期间测定其每分钟平均吸光度变化（△A/分）。在此反应体系中，温度控制在37℃，比色波长为340nm，比色杯光径为1cm.

(3) 计算：

CK（U/L）= △A/分×4127×样品稀释倍数（10）

2.4.1.3 血浆肌酸激酶（CK-MB）的测定：

（1）原理：肌酸激酶是一种二聚物。它的单体次单位被命名为M（muscle）和 B(brain,nerve cells)。这些次单位结合形成三种同功酶即CK-BB、CK-MB 和CK-MM。 CK-MB 和CK-MM 中的M 次单位借着和anti-M 抗体（免疫抑制）反应而停止活动。残余的B 次单位则以酵素法加以测量。

（2）操作步骤：

     取适量血清，用蒸馏水作1：9 稀释作为待测样本。将试剂1 和试剂2 以4：1 的比例配制成一定量的混合试剂,预先保温至37℃。取混合试剂1 ml、稀释后血清0.04 ml，将二者充分混合。在5 分钟后测定其初吸光度值并且开始计时。分别在1 分钟、2 分钟和3 分钟时测其吸光度值，在线性实验期间测定其每分钟平均吸光度变化（△A/分）值。在此反应体系中，温度控制在37℃，比色波长为340nm，比色杯光径为1cm.

(3) 计算：

CK-MB（U/L）= △A/分×8254×样品稀释倍数（10）

2.4.1.4 血浆天门冬氨酸氨基转移酶（AST）的测定：

   连续监测法（2：1）全自动型（液体）。

   使用日本7150 型全自动生化分析仪进行。

（1） 原理：

L-天门冬氨酸 +α-酮戊二酸     AST      草酰乙酸 + L-谷氨酸

 

 草酰乙酸+ NADPH+ H⁺     MDH       L-苹果酸 + NAD⁺+ H₂O

（2） 操作步骤：

 全自动生化分析仪：主波长：340nm。副波长：405nm。温度：37℃。比色杯光径：1cm。

试剂开瓶即可使用。按下表进行操作：

	空白管	样品管
样品	——	30μl
蒸馏水	30μl	——
R1	500μl	500μl

混匀，保温5分钟

R2

250μl

250μl

混匀，保温1分钟，准确测定1分钟吸光度变化

(3) 计算：

AST（U/L）= （△A_样品/分—△A_空白/分）×F

F = Vt/Vs×消光系数×1000 = 4127

       Vt = 反应总体积   Vs = 样品体积

       NADH在340nm 波长下毫克分子消光系数 = 6.3

2.4.1.5 血浆乳酸脱氢酶（LDH）的测定：(LDL速率法)

     使用日本7150 型全自动生化分析仪进行。

（1）原理：乳酸脱酸酶催化L-乳酸到丙酮酸的正向脱氢反应，使氧化型辅酶I（NAD⁺）还原生成还原型辅酶I（NADH），引起340nm 波长处吸光度的升高与血清中乳酸脱氢酶的活力成正比。反应式如下：

   L-乳酸+ NAD⁺       MDH       丙酮酸 + NADH+ H⁺ 

（2）操作步骤：

     全自动生化分析仪：波长：340nm。温度：37℃。比色杯光径：1cm。按下表进行操作：

	空白管	样本管
样本	——	0.05ml
生理盐水	0.05ml	——
R1	2.00ml	2.00ml

分别混匀，在37℃保温5分钟

R2

0.60ml

0.60ml

分别混匀，在37℃保温1分钟，以空白管校零，计算每分钟吸光度变化率（△A/min_样本）

先将R1和R2按照10：3的比例混匀配制成工作液，然后将工作液和样本按照65：2的比例混匀，上机测定。

(3) 计算：

          C_样本 = △A /min_样本 × K

        K =  V_总/V_样本×消光系数×1000

NADH在340nm波长下毫克分子消光系数 = 6.3

2.4.1.6 血浆α-羟丁酸脱氢酶（HBDH）的测定：（速率法）

     使用日本7150 型全自动生化分析仪进行。

（1）原理：α-羟丁酸脱氢酶（HBDH）催化α-酮丁酸还原生成α-羟丁酸，同时使还原型辅酶I（NADH）氧人成氧化型辅酶I（NAD⁺）。使用生化分析仪检测340nm处吸光度的变化，可知被检测血清中α-羟丁酸脱氢氢酶的活性。

   α-酮丁酸 + NADH     HBDH   α-羟丁酸 + NAD⁺ 

（2）操作步骤：

全自动生化分析仪：波长：340nm。温度：37℃。比色杯光径：1cm。按下表进行操作：

	空白管	样本管
样本	——	0.03ml
生理盐水	0.03ml	——
R1	0.72ml	0.72ml

分别混匀，在37℃保温5分钟

R2

0.18ml

0.18ml

分别混匀，在37℃保温1分钟后，以空白管校零，计算每分钟吸光度变化率（△A/min_样本）

先将R1和R2按照4：1的比例混匀配制成工作液，然后将工作液和样本按照30：1的比例混匀，上机测定。

(3) 计算：

          C_样本 = △A /min_样本 × K

        K =  V_总/V_样本×消光系数×1000

NADH在340nm波长下毫克分子消光系数 = 6.3

2.4.1.7 血浆MDA 的测定：

（1）测定原理：

     丙二醛（MDA）是过氧化脂质降解的产物，它可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合形成一种红色物质，此物质在532nm 处有最大吸收峰，通过对此物质的测定，可推算出丙二醛的含量。

（2）测定方法（按下表进行操作）：

	标准管	标准空白管	测定管	测定空白管
10nmol/ml 标准品（ml）	0.2
无水乙醇（ml）		0.2
血浆（ml）			0.2	0.2
试剂1（ml）	0.2	0.2	0.2	0.2

混匀

试剂2（ml）	3	3	3	3
试剂3（ml）	1	1	1
50%冰醋酸（ml）	1

旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧并用针头刺一小孔，95℃水浴（或用锅开盖煮沸）40 分钟，取出后流水冷却，然后3500-4000转/分，离心10 分钟。用移液器吸取上清，532nm 处、1cm 光径、蒸馏水调零测各管吸光度值。

（3）计算公式：

血浆MDA(nmol/ml)＝×标准品浓度（10nmol/ml）×样本测试前稀释倍数

2.4.1.8 血浆XOD 的测定

（1）测定原理：

    次黄嘌呤可被XOD催化而生成黄嘌呤，与此同时会产生超氧阴离子自由基，在有电子受体及显色剂同时存在的情况下，生成紫红色的结合物，根据紫红色物质的具体量便可推算出XOD 的活力。

（2）测定方法（按下表进行操作）：

	空白管	测定管
蒸馏水（ml）	0.02
血浆（ml）		0.02
试剂1（ml）	1	1
试剂2（ml）	0.05	0.05
试剂3（ml）	0.2	0.2
试剂4（ml）	0.02	0.02

混匀，37℃水浴20分钟

试剂5（ml）

1

1

混匀，530nm处,1cm 光径，蒸馏水调零，比色读取吸光度值(OD)

注：血浆在测试前经3000 转/分10 分钟离心，小心吸取上清进行测定。

（3）XOD 活力计算：

   1) 单位定义：

     每克组织蛋白在37℃每分钟转化1μmol 的底物所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

   2）计算公式：

血浆XOD(U/L)＝ ×反应液总体积取样量×1光径×反应时间

2.4.1.9 血浆SOD 的测定

 （1）测定原理：

     黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统可产生超氧阴离子自由基，此物质可氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下显示紫红色，用可见光分光光度计可测其吸光度值。SOD 是自由基清除酶，被测样品中含有的SOD 对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，可使形成的亚硝酸盐减少，紫红色显色物含量减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管。通过公式计算可求出被测样品的SOD 活力。

（2）测定方法（按下表进行操作）：

试剂	测定管	对照管
试剂1（ml）	1.0	1.0
血浆（ml）	0.05
蒸馏水（ml）	0.5	0.55
试剂2（ml）	0.1	0.1
试剂3（ml）	0.1	0.1
试剂4（ml）	0.1	0.1

旋涡混匀器充分混匀，37℃水浴40分钟

显色剂（ml）

2

2

混匀，室温放置10min， 550nm 处,1cm 光径，蒸馏水调零，比色读取吸光度值(OD)。

（3）SOD 活力计算：

1) 单位定义：

每毫克组织蛋白在1 毫升反应液中SOD 抑制率达50%时所对应的SOD 量为一个SOD 活力单位（U）。

2) 计算公式：

血浆SOD(U/ml)＝ 50%×反应体系的稀释倍数×样本测试前的稀释倍数

2.4.1.10 心肌组织MDA 的测定：

（1）测定原理：

     丙二醛（MDA）是过氧化脂质降解的产物，它可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合形成一种红色物质，此物质在532nm 处有最大吸收峰，通过对此物质的测定，可推算出丙二醛的含量。

（2）测定方法（按下表进行操作）：

	标准管	标准空白管	测定管	测定空白管
10nmol/ml 标准品（ml）	0.2
无水乙醇（ml）		0.2
10%组织匀浆（ml）			0.2	0.2
试剂1（ml）	0.2	0.2	0.2	0.2

混匀

试剂2（ml）	3	3	3	3
试剂3（ml）	1	1	1
50%冰醋酸（ml）	1

旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧并用针头刺一小孔，95℃水浴（或用锅开盖煮沸）40 分钟，取出后流水冷却，然后3500-4000转/分，离心10 分钟。用移液器吸取上清，532nm 处、1cm 光径、蒸馏水调零测各管吸光度值。

（3）计算公式：

组织MDA(nmol/mgprot)＝×标准品浓度（10nmol/ml）÷组织中蛋白含量（mgprot/ml）

2.4.1.11 心肌组织XOD 的测定

（1）测定原理：

    次黄嘌呤可被XOD催化而生成黄嘌呤，与此同时会产生超氧阴离子自由基，在有电子受体及显色剂同时存在的情况下，生成紫红色的结合物，根据紫红色物质的具体量便可推算出XOD 的活力。

（2）测定方法（按下表进行操作）：

	空白管	测定管
蒸馏水（ml）	0.02
10%组织匀浆（ml）		0.02
试剂1（ml）	1	1
试剂2（ml）	0.05	0.05
试剂3（ml）	0.2	0.2
试剂4（ml）	0.02	0.02

混匀，37℃水浴20分钟

试剂5（ml）

1

1

混匀，530nm处,1cm 光径，蒸馏水调零，比色读取吸光度值(OD)

注：血浆在测试前经3000 转/分10 分钟离心，小心吸取上清进行测定。

（3）XOD 活力计算：

   1) 单位定义：

     每克组织蛋白在37℃每分钟转化1μmol 的底物所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

   2）计算公式：

组织XOD(U/gprot)＝ ×反应液总体积取样量×1光径×反应时间÷蛋白含量

2.4.1.12 心肌组织SOD 的测定

 （1）测定原理：

     黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统可产生超氧阴离子自由基，此物质可氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下显示紫红色，用可见光分光光度计可测其吸光度值。SOD 是自由基清除酶，被测样品中含有的SOD 对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，可使形成的亚硝酸盐减少，紫红色显色物含量减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管。通过公式计算可求出被测样品的SOD 活力。

（2）测定方法（按下表进行操作）：

试剂	测定管	对照管
试剂1（ml）	1.0	1.0
10%组织匀浆（ml）	0.05
蒸馏水（ml）	0.5	0.55
试剂2（ml）	0.1	0.1
试剂3（ml）	0.1	0.1
试剂4（ml）	0.1	0.1

旋涡混匀器充分混匀，37℃水浴40分钟

显色剂（ml）

2

2

混匀，室温放置10min， 550nm 处,1cm 光径，蒸馏水调零，比色读取吸光度值(OD)。

（3）SOD 活力计算：

1) 单位定义：

每毫克组织蛋白在1 毫升反应液中SOD 抑制率达50%时所对

应的SOD 量为一个SOD 活力单位（U）。

2) 计算公式：

组织SOD(U/mgprot)＝ 50%×组织中蛋白含量(mgprot /ml)

2.4.1.13 心肌组织中MPO 的测定

(1) 测定原理：

    MPO 主要存在于中性粒细胞(PMN)中，每个细胞中所含的MPO 的量是一定的，约占细胞干重的5%。该酶具有还原过氧化氢的能力，并与供氢体邻连茴香胺生成黄色化合物，在460nm 处比色测定有色物的量，可推算出MPO 的活力和白细胞的数目。

(2) 测定方法：

   准确称取组织重量，以配好的试剂二溶液为匀浆介质，按重量体积比为1：19 加匀浆介质制备成5%的组织匀浆，不需要进行离心。取5%组织匀浆0.9 ml 加3 号试剂0.1ml，充分混匀后37℃水浴15 分钟，取出后再按下表进行操作。

试剂	试剂空白	对照管	测定管
双蒸水（ml）	0.2	3
样本（ml）		0.2	0.2
试剂四（ml）	0.2	0.2	0.2
显色剂（ml）	3		3

混匀，水浴30分钟

试剂七（ml）

0.05

0.05

0.05

混匀，60℃水浴10 分钟，取出后立即在460nm 处,1cm 光径，蒸馏水调零，比色读取各管吸光度值(OD)

（3）MPO 酶活力计算：

1）酶活力单位定义：每克组织湿片在37℃的反应体系中H2O2被分解1μmol 为一个酶活力单位（U）。

2）计算公式：

MPO单位/克湿片＝

2.4.2 形态学指标检测

     手术中留取的心肌组织块常规脱水、包埋、切片、二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、HE 染色、二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察心肌组织形态学改变。

3.统计方法

用SPSS11.5统计软件进行统计学处理。数据以均数±标准差（`X±s）表示，用方差分析q 检验统计处理。p<0.05 为差异有显著性，p<0.01为差异极有显著性。

 

结　　果

    

1.1 各组动物血CK、CK-MB、AST、LDH、HBDH 含量变化     

与Control 组比较，IR 组，血浆CK、CK-MB、AST、LDH、HBDH有不同程度升高， CK、CK-MB、AST、LDH、HBDH分别是Control组的36.6倍、34.5倍、32.3倍、34.9倍、和32.9倍（p <0.05）；与IR组比较，IPC 组血浆CK、CK-MB、AST、LDH、HBDH降低了1.75倍、1.81倍、1.63倍、1.79倍、1.65 倍（p <0.01）；IPC组与Control组比较，血浆CK、CK-MB、AST、LDH、HBD升高了20.9倍、19.24倍、18.7倍、19.30倍、18.98 倍。结果见表1、表2，图1、图2。

 

Table 1 The content of CK、CK-MB in plasma in different groups (`x± s)

Group	n	CK（103U/L）		CK-MB（103U/L）
Control	10	0.42±0.06	0.55±0.12
IR	8	15.37±1.67# #	19.12±2.48# #
IPC	8	8.78±1.56# #▲▲	10.58±0.73# #▲▲

# # p <0.01 # p <0.05, vs Control group; ▲▲p<0.01▲p<0.05，vs IR group   

              

Table 2 The content of　AST、LDH、HBDH in plasma in different groups (`x ± s) 

Group		n			AST（103U/L）		LDH（103U/L）     HBDH（103U/L）
Control	10				0.48±0.06		0.49±0.12       0.60±0.11
IR			8		1.837±0.67# #      2.832±0.48# #        1.987±0.58# #
IPC	8			0.748±0.26# #▲▲		1.058±0.41##▲▲    1.132±0.33# #▲▲

# # p <0.01 # p <0.05, vs Control group; ▲▲p<0.01▲p<0.05，vs IR group　　

 

 

 

 

 

图1 各组动物血浆CK、CK-MB含量的变化

 

 

图2 各组动物血浆AST、LDH和HBDH含量的变化

 

1.2 各组动物血浆MDA、XOD、SOD 含量变化

   与Control组比较，IR组动物血浆MDA升高了1.85倍（p <0.01），XOD 升高了1.21倍（p <0.01），血浆SOD 值降低了1.33倍（p <0.01）。与IR 组比较，IPC组动物血浆MDA 降低了1.28倍（p <0.05），XOD 降低了1.14倍（p <0.05），而血浆SOD 升高了1.15倍（p <0.05）。IPC组与Control组比较，血浆MDA、XOD 降低了1.44倍、1.07倍，而血浆SOD 升高了1.15倍。结果见表3、图3。

 

Table 3 The content of  MDA、XOD 、SOD in plasma in different groups (`x ± s) 

Group	n			MDA（nmol/ml）				XOD (U/L)    SOD (U/L)
Control		10				14.69±2.48	35.28±10.43       17.90±5.97
IR			8		28.66±3.77# #           79.31±4.93# #          13.47±2.55# #
IPC			8		18.76±4.53# #▲		49.81±6.54# #▲             15.54±3.54# #▲

# # p <0.01 # p <0.05, vs Control group; ▲▲p<0.01▲p<0.05，vs IR group

 

 

图3 各组动物血浆MDA、XOD和SOD含量

 

1.3 各组动物心肌组织MDA、XOD和SOD水平的变化

与Control组比较，IR组动物心肌组织MDA升高了1.8倍（p <0.01），XOD 升高了1.21倍（p <0.01），心肌组织SOD 值降低了1.32倍（p <0.01）。与IR 组比较，IPC组动物心肌组织MDA 降低了1.28倍（p <0.05），XOD 降低了1.14倍（p <0.05），而心肌组织SOD 升高了1.15倍（p <0.05）。IPC组与Control组比较，心肌组织MDA、XOD升高了1.44倍、1.07倍，而心肌组织SOD降低了1.15倍。结果见表4、图4。

 

 

Table 4 The content of myocardium MDA、XOD 、SOD in different groups ( `x ± s) 

Group	n*			MDA（nmol/mgprot）				XOD (U/gprot)  SOD (U/mgprot)
Control		10				4.99±0.44	68.28±10.43       19.90±0.97
IR			8		7.66±0.77# #           83.31±4.93# #         12.47±1.55# #
IPC			8		6.04±0.53# #▲		75.81±4.54# #▲         16.54±0.53# #▲

# # p <0.01 # p <0.05, vs Control group; ▲▲p<0.01▲p<0.05，vs IR group

 

 

图4 各组动物心肌组织MDA、XOD和SOD含量

 

1.4各组动物心肌组织MPO水平

与 Control 组比较，IR 组心肌组织MPO 升高了1.55倍（p<0.01），IPC 组心肌组织MPO 升高了1.14倍（p<0.01 或p<0.05）。IPC 组与IR 组比较，MPO 降低了1.35倍（p<0.05）。结果见表5、图5。

 

 

 

 

 

 

Table 5 The content of myocardium MPO in different groups ( x ± s) 

Group		n				MPO（U/g.w）
Control	10			5.52±0.99
IR			8	8.54±0.77# #
IPC	8				6.31±0.52#▲

# # p <0.01 # p <0.05, vs Control group; ▲▲p<0.01▲p<0.05，vs IR group

 

图5  各组动物心肌组织 MPO 含量的变化

 

1.5心肌组织结构变化

HE 染色，镜下观察可见：Control 组心肌纤维排列整齐，无细胞变性及溶解，无炎性细胞浸润，高倍镜下横纹清晰可见；IR 组部分心肌纤维断裂、横纹不清楚，少数心肌细胞变性，个别溶解，有炎性细胞浸润。IPC组病理改变有所减轻，仍有炎性细胞浸润。见图6-8

 

 

 

 

 

 

 

 

讨　　论

 

组织、器官的缺血再灌注（Ischemia Reperfusion, IR）除可造成组织、器官本身严重的病理改变外，伴随着机体内环境的破坏，代谢的紊乱，损伤还可由局部波及远端脏器。肢体缺血再灌注（Limb Ischemia Reperfusion,LIR）在引起缺血肢体损伤的同时，也可继发其它远隔组织器官的病理变化^[3]，严重时引起多器官功能障碍综合征^[4]（multiple organdysfunction syndrome, MODS），心肌的损伤便是MODS 的重要表现之一。

1.动物模型的可靠性

    多年以来，我科室一直沿用的止血带法^[5]操作比较简单，无手术创伤，是研究LIR 时最为常用的动物模型制作方法，即：将止血带置于肢体近端迅速阻断动静脉血流，规定时间后再松解止血带使血流得以再通。缺血期间，所结扎肢体远端皮肤颜色先苍白后青紫，触之冰凉。松解后全身血压渐进性下降，肢体逐渐温热，肤色转红，局部水肿明显。在我科室多年的前期研究中，经平均动脉压（mean arterial pressure，MAP）的动态监测、激光多谱勒血流仪监测血流情况及活体动物观察，证实此法具有可靠性和可行性。

2.心外因素造成心肌组织损伤的实验依据

    研究表明，机体经受严重创伤、严重感染、缺血再灌注损伤等剧烈应激反应时，心脏可能发生可逆转或不可逆转的损伤性变化^[6]。姚季生^[7]等经尾静脉给大鼠注射去甲肾上腺素，发现心肌有多灶性坏死且病灶内心肌深嗜伊红性改变，部分肌原纤维断裂溶解等病理改变。巩鹏^[8]等报道，胆道梗阻可通过远隔效应引起心肌线粒体及细胞膜损伤而发生心肌坏死。大鼠颅脑损伤后血浆CK-MB 含量显著升高，镜下可见心肌明显的病理表现^[9]， Rapenne^[10]等也有类似报道。在下肢IR 中，心、肺是最易受累的远位靶器官^[11]。有文献报道^[12]，LIR引起的氧化应激反应可造成肺水肿甚至呼吸功能障碍。遭受一段时间缺血损伤的肢体，恢复血液灌流后不仅发生局部骨骼肌的再灌注损伤（reperfusion injury，RI），机体还可能出现血压进行性降低的全身应，称为止血带休克（tourniquet shock,ToS）^[28]。1944 年Jesse等^[13]对止血带引发休克进行研究时发现，止血带使用3 小时以上休克发生的可能性极大。任会荣^[14]等建立肢体束缚应激动物模型，也观察到心肌线粒体膜明显的损伤变化。骨骼肌细胞缺血一定时间后恢复血流灌注，细胞损伤胞浆内容物释放入血，血液性状及成分明显异常^[15]。心脏是接受下肢血液回流的第一站。再灌注血液经下腔静脉到右心房再灌流全心，缺血期生成的毒性代谢产物及再灌注期形成的大量炎症介质，会随着再灌注血流到达心脏并进一步播散到全身。心脏需氧量大，能量代谢过程复杂，下肢的缺血再灌注可经多种机制影响心肌的代谢和功能活动，造成心肌组织损伤。

3.缺血后适应对心肌酶学的影响

肌酸激酶（creatine kinase,CK）是主要分布在心肌和骨骼肌细

胞中的胞浆酶，而肌酸激酶MB 同工酶（CK-MB）在心肌细胞中含量最多。在本模型中，血浆CK 的变化受骨骼肌和心肌细胞损伤的双重影响，而血浆CK-MB 的变化很大程度上取决于心肌细胞膜的完整性。血清CK 和CK-MB 的同步升高，可作为心肌细胞受损的特异性标志 ^[16]。本实验研究发现IR 组、IPC 组动物血清CK 及CK-MB 均呈不同程度升高（p <0.01, p <0.05）。据此可推测LIR 后心肌细胞发生了结构的损伤性变化。与此同时，本实验研究发现IR 组、IPC 组动物血清其它几项心肌酶AST 、LDH 及HBDH 均呈不同程度升高（p <0.01, p <0.05）。这也说明了LIR 后心肌细胞发生了结构的损伤性变化。刘水平等^[17]在研究大鼠后肢严重的挤压伤对心肌的影响时，也得到相似的结果。在LIR过程中，PMN 激活引发的OFR及SIRS引发的脂质过氧化反应，可对心肌细胞线粒体的结构和功能造成一定的影响，引起心肌能量代谢的障碍。IPC组可能由于血浆中，代射毒物的减少了，缓解了OFR 的作用，对心肌细胞起到一定的保护作用。因此，与IR 组相比，IPC 组CK、CK-MB 有所下降，AST 、LDH 及HBDH 也有明显的减低。这些变化可作为缺血后适应可以减轻LIR后心肌损伤的有力证据。

4.氧自由基的损伤作用

氧自由基化学性质较为活泼，可破坏机体正常氧化/还原的动态平衡，形成严重的氧化应激(oxidative stress)状态，对生物大分子（核酸、蛋白质、脂质）造成过氧化性损伤，影响正常的生命活动。LIR 过程中体内有大量的自由基产生，这可作为缺血再灌注造成远位器官损伤的主要机制。其中氧自由基（OFR）可通过级联反应损伤心肌细胞膜及心脏血管内皮细胞。丙二醛（MDA）性质稳定，是OFR 攻击膜性成分多不饱和脂肪酸的终产物，它还可以进一步引起蛋白质、磷脂和核酸的交联而加重组织损伤。组织MDA 水平可作为反映自由基损伤程度的指标^[18]。XOD 是生成OFR 的催化酶，其在催化次黄嘌呤及黄嘌呤代谢的过程中，有大量超氧阴离子（O2∙）产生。SOD 是一种金属蛋白，可以歧化O2`∙ 生成 H2O2并可进一步清除H2O2，是体内主要的酶性自由基清除剂。MDA、XOD、SOD 可作为机体脂质过氧化损伤程度的间接指标。实验结果显示：与Control 组比较，在经受LIR 的两组心肌组织中SOD 含量降低，而XOD 和MDA 含量均明显增加，提示心肌组织中自由基产生过多，心脏及整个机体处于氧化应激状态。SOD 含量的降低与缺血缺氧使其生成不足^[19]和清除自由基时消耗过多有直接关系。与IR 组相比较，IPC 组XOD 和MDA 含量均明显减低，而SOD 含量增高。氧自由基相关指标在IR 组与IPC组间的差别正说明了缺血后适应对心肌的保护作用。

5.中性粒细胞的作用

    炎症是活体组织对损伤的反应，LIR 可引起体内严重的炎症反应，甚至发生全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response

syndrome, SIRS）。SIRS 是机体失控的、自我持续放大的、自我破坏的炎症，表现为播散性炎症细胞活化(disseminated activation of

inflammatory cell) 和炎症介质泛滥(inflammatory mediator spillover)。 史中立^[20]等报道，LIR 产生大量活性氧及炎症介质，血小板及PMN 被激活，最终可导致SIRS 的发生。中性粒细胞（PMN）是使始发于肢体局部的炎症进一步播散到全身的重要角色。缺血期，骨骼肌细胞膜磷脂降解释放出大量趋化因子，如白三烯、血小板活化因子（PAF）、补体和激肽等，吸引PMN 聚集并进入缺血组织。再灌注期细胞间粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）和内皮细胞-白细胞粘附分子（endothelial leukocyte adhesionmolecule,ECAM）表达增强，加剧了缺血组织内PMN 激活和积聚的过程。激活的PMN 又释放白细胞介素（interleukin,IL）等细胞因子，促进更多PMN的积聚和浸润，从而形成恶性循环（vicious cycle）。如IL-1β可参与膜PLA2激活^[21,22]，从而将外界损伤信号传入体内并进一步播散。激活的PMN 及炎症介质可随血流转移到全身组织，通过NADPH 氧化酶的作用，催化O2生成O2`∙,并进一步转化为H2O2。PMN 内的髓过氧化物酶（MPO）有催化H2O2与CL-、I-生成HOCL 或HOI 等强氧化剂的作用，进一步引起巯基氧化、细胞色素失活及氨基酸、蛋白质降解等严重的损伤反应。血管内皮细胞之间的紧密连接松解是血管壁通透性增加的结构基础^[23]。PMN 可分泌弹性蛋白酶，分解胶原、破坏结缔组织和血管内皮细胞基底膜，造成微血管壁通透性增高，严重影响机体内环境的稳定。因此，PMN 是反映血管壁通透性乃至组织损伤的直接标志之一。MPO 是PMN 嗜天青颗粒中含量较高的酶，每个PMN 中所含MPO 的量相对恒定，所以组织中MPO 活性的高低基本上可定量表示组织中PMN的数量^[24]。在本研究中，肢体的剧烈疼痛、局部的毒性代谢产物、激活的PMN、炎症介质及其他细胞因子的释放均可导致心肌损伤的加重。缺血后适应是在LIR 过程中，通过反复的松解止血带，减少了组织中毒性物质的入血，同时也减小了组织血流恢复对心脏血流的影响。在一定程度上避免了相关毒性物质进入机体内环境，减少了对内环境的破坏，一定程度上保证了机体内环境功能的正常作用，减轻了心肌的损伤。在本研究中，与Control 组相比，经受LIR 的动物心肌组织中MPO 活性均增加，IPC 组心肌组织MPO 活性较IR 组有所下降。提示缺血后适应过程对PMN 的活化及引起炎症反应的扩散有一定抑制作用。

6.心肌组织的形态学改变

组织形态结构异常是组织、器官功能代谢障碍的基础。组织切片HE 染色镜下观察，IR 组和IPC 组动物的心肌组织有不同程度的病理学改变，高倍镜下可见心肌部分横纹不清晰，少数心肌细胞变性，有炎性细胞浸润。这与胡佳乐^[1] 、陈建常^[25]、冯艳^[26]等人的报道一致。IR 组低倍镜下偶见心肌波浪状改变，这种特殊的病理形态变化形成机制^[27]可能是由于部分心肌纤维弹性下降甚至失去收缩能力，在心脏搏动过程中，收缩功能正常的心肌纤维使停止收缩心肌纤维受到反复强烈的牵拉，逐渐被拉长的心肌纤维进而又被迫弯曲而形成波浪状改变。OFR的脂质过氧化损伤作用可能是引起心肌组织病理学改变的主要机制。其次，SIRS 引起的内环境紊乱及心脏微循环障碍也可能参与心肌结构的损伤。此外，水、电解质代谢与酸碱平衡紊乱 ^[28]、心肌能量代谢障碍等也有助于心肌组织形态的异常。

 

 

 

结　　论

 

1.大鼠LIR 可引起心肌损伤。

2.机体的氧化应激状态可能是LIR继发心脏损伤的主要机制之一。

3.缺血后适应可减轻大鼠LIR后的心肌损伤，其机制与抑制氧化应激、减轻炎症反应有关。

 

 

 

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