姚月明¹ 邵洪波 ²

¹河北省石家庄心脑血管病医院骨科  ²河北医科大学第一医院烧伤整形外科

【摘要】 目的：通过建立家兔实验性膝关节炎模型，观察注射透明质酸钠(Sodium hyaluronate，SH)后家兔的实验性膝关节炎关节软骨及关节液的变化，探讨SH对关节软骨及关节液的影响，验证SH对膝关节骨性关节炎的治疗作用。方法:成年健康家兔36只，耳缘静脉麻醉，右膝取髌内侧切口，切断内侧副韧带，打开关节腔，切断前后叉韧带及内外侧半月板，术中不损伤关节软骨面，模型复制成功后，随机分成对照组和SH治疗组，每组各18只。对照组于模型复制后第4周进行膝关节腔内注射生理盐水0.1ml/kg，SH治疗组在模型复制后第4周进行右膝关节腔内注射透明质酸钠0.1ml/kg，每周一次，连续注射5次。两组在模型复制后第5、9、13周随机抽取6只家兔处死。抽取右膝关节液，打开右膝关节腔，肉眼观察软骨及关节液变化并记录；取右膝关节股骨髁软骨，进行病理观察。根据实验数进行统计分析。结果：在模型复制后第5周两组关节软骨外观无明显区别，软骨深层病理改变及细胞改变病理积分比较无显著性差（P>0.05），而关节液的改变有明显的区别，关节软骨表层病理积分及总积分比较有显著性差异（P<0.05）；两组在第9周、第13周观察的结果比较中，均有明显的改变，积分比较均有显著性差异（P<0.05）或（P<0.01）。结论: 关节腔内注射SH后，明显改善了膝关节炎时关节液的浑浊情况，恢复了关节液的正常粘度；也明显延缓了膝关节炎中关节软骨的破坏进程，治疗效果良好。

【关键词】：骨关节炎  膝关节  透明质酸钠  组织病理学

【中图分类号】R684.3      【文献标识码】A

 

【Abstract】Objective: Through the establishment of experimental arthritis model in rabbits to observe the injection of sodium (Sodium hyaluronate, SH) of experimental rabbits after knee articular cartilage and synovial fluid changes of SH on the articular cartilage and synovial fluid of verify the SH on the treatment of osteoarthritis of the knee function.Method: 36 healthy adult rabbits, ear vein injection with 1% sodium pentobarbital, The sterilized rabbit skin preparation right knee, take the medial patellar incision, cutting the medial collateral ligament, open the joint cavity, cutting off the fork before and after the ligament and the lateral meniscus, surgery does not damage the articular cartilage surface. Complete hemostasis, suture. The right lower limb extensor bit cast immobilization for 3 weeks. The model replicated after 36 rabbits were randomly divided into control group and the SH treated group, 18 rats in each group. Right knee in the rabbit model of the control group 4 weeks after copying the knee articular injection of saline 0.1ml/kg, SH replicated in the model group 4 weeks after injection of sodium hyaluronate right knee joint cavity of 0.1ml / kg, once a week injection of 5 times. the two groups in the model 5,9,13 weeks after copying randomly selected six rabbits, air embolism death. Right knee joint fluid extraction, open the right knee joint cavity, visual observation of cartilage and synovial fluid changes and record. Take the right femoral condyle cartilage, for pathological observation,and statistical analysis. Results: In the model replication 5 weeks after two cartilage look no significant difference between the cartilage of deep pathological changes and cellular changes in the pathological points showed no significant difference(P>0.05), and synovial fluid changes significantly different, the articular cartilage surface of the pathological points and total score were significantly difference (P<0.05); the two groups in the first 9 weeks,13-week observation comparison of the results,the changes are obvious,points were significantly difference (P <0.05) or (P <0.01). Conclusion: intra-articular injection of SH, the significant improvements in knee joint fluid when the turbid situation, restore the normal viscosity of joint fluid. SH was significantly delayed another knee articular cartilage damage in the process of treatment is good. In this study, the clinical use of SH for the treatment of knee osteoarthritis provide some pathological basis.

【Key words】: Osteoarthritis, Knee, Sodium hyaluronate, Histopathology

退行性骨性关节炎（Osteoarthritis,OA）是一种以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节疾病，其病理主要表现为关节软骨功能减退，周围基质降解加速，从而导致关节软骨退行性变，关节表面、边缘及软骨下形成新骨^[1]。透明质酸钠（SH）是一种细胞外基质中普遍存在的成分，广泛存在于动物结缔组织的黏多糖中，是关节液中的重要成分之一，有润滑关节、保护软骨、改变关节液PH值等作用。所以，在膝关节骨性关节炎患者中多用补充透明质酸钠作为治疗手段^[2]。另外，还有多项研究显示SH能够抑制软骨的退化并减少软骨细胞外基质中蛋白聚糖的释出^[3]。它还能保护关节软骨的表面，使骨膜液的性质正常化并降低疼痛感。根据SH对OA的作用，本研究从组织形态学观察SH的疗效，为临床应用和深入研究其作用机理提供一定的理论依据。

1材料与方法

1.1实验对象及仪器：成年健康家兔36只（河北医科大学动物实验中心提供），体重在2.5±0.5kg，雌雄不拘，雌兔未孕。Leica石蜡切片机（Germany），Olympus双目光学显微镜（Japan），Leica摊片机（Germany），Leica烘片机（Germany），精密PH计PHS-3C             （上海精密科学仪器有限公司），全自动脱水机（孝感市亚光医用电子技术有限公司），德国徕卡切片机（上海天呈科技有限公司），TEC-2800自动组织包埋机（常州市郝思琳医用仪器有限公司），TST-1200 病理组织取材台（常州市郝思琳医用仪器有限公司），TEC-2900蜡块修整器（武汉俊杰电子有限公司），LST-94 电脑全自动组织染色机（孝感亚光医用电子技术有限公司）。戊巴比妥钠粉剂（中国医药分公司北京采购供应站）（25g/瓶，用生理盐水稀释成1%溶液），15%乙二胺四乙酸（EDTA）（石家庄杰克化工有限公司），10%福尔马林                  （石家庄杰克化工有限公司），透明质酸钠注射液（阿尔治）（25mg：2.5ml/瓶）（昆明贝克诺顿制药有限公司），0.9%生理盐水（石家庄杰克化工有限公司）。

1.2实验方法：将家兔称重后，记录在册。以一侧兔耳耳缘静脉部位拔毛、75%的酒精消毒后，用1%戊巴比妥钠溶液，按30mg/kg(3ml/kg)剂量给家兔耳缘静脉注射，必要时可追加1%戊巴比妥钠溶液0.6ml/kg。将家兔右膝备皮消毒，铺无菌巾。取髌内侧切口，切断内侧副韧带，打开关节腔，显微剪刀切断前后叉韧带及内外侧半月板，术中不损伤关节软骨面，彻底止血，逐层缝合。伸膝位石膏固定右下肢3周^[4]。模型复制后将36只家兔随机分成对照组和SH治疗组，每组各18只。对照组家兔右膝于模型复制后第4周进行膝关节腔内注射生理盐水0.1ml/kg，SH治疗组在模型复制后第4周进行右膝关节腔内注射SH 0.1ml/kg，每周一次，连续注射5周。

1.3标本的采集：对照组及SH治疗组分别在模型复制后第5、9、13周随机抽取6只家兔，空气栓塞处死，抽取右膝关节液，打开右膝关节腔，肉眼观察软骨及关节液变化并记录。取右膝关节股骨髁软骨，标本用10%福尔马林固定24小时，10%EDTA脱钙10天，石蜡包埋后切片。切片部位取股骨髁软骨标本前外象限的1/2交界处，苏木素-伊红染色^[5]。

1.4观察指标：家兔右膝关节关节液、股骨髁软骨，（1）关节液形状、色泽及粘度(做拉丝现象)观察；（2）新鲜软骨标本大体观察；（3）软骨组织标本经石蜡包埋、HE染色后，光镜下观察病理组织结构的变化（×100）。

1.5统计学分析：每张切片选择10个不同视野，并参照C.Colombo关节软骨病理积分标准^[6]（见附表1）进行积分统计。实验所得数据均用均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS11.0软件进行非参数检验。

2 结果

2.1模型复制后第5周两组观察结果比较

2.1.1模型复制后第5周大体观察关节软骨及关节液变化的比较：正常关节软骨外观呈蓝白色，色泽明亮，无裂纹及软化。关节液无色透明，粘度良好^[7]。本实验模型复制后第5周时两组关节软骨有光泽，略发黄，软骨触之均较硬，外观无明显区别；对照组关节液量增多，浑浊，拉丝现象差；SH治疗组关节液量增多，略有浑浊，拉丝良好。

2.1.2模型复制后第5周光镜病理观察结果比较：根据C.Colombo关节软骨病理积分标准（附表1），将两组各时相总积分进行比较（附表2），将关节软骨病理改变分为表层病理改变、深层病理改变及细胞病理改变；表层病理改变有表层缺损、糜烂或溃烂及表面脆裂，将两组各时相此三项积分相加后进行比较（附表3）；深层病理改变有裂纹、软骨下囊肿、骨赘及软骨下骨暴露，将两组各时相此四项积分相加后进行比较（附表4）；细胞病理改变有细胞成簇及软骨细胞缺失，将两组各时相此二项积分相加后进行比较（附表5）^[8]。

本实验模型复制后第5周时，对照组关节软骨表层出现少许糜烂，表面局部少有脆裂，深层有细小裂纹，无软骨下囊肿及骨赘形成，软骨细胞减少，细胞成簇存在（附图1）；SH治疗组软骨表面无脆裂出现，基本未见到明显溃疡面，软骨细胞稍减少，排列尚整齐，细胞也成簇存在（附图2）。

模型复制后第5周两组关节软骨病理总积分比较差异有显著性（P<0.05）（附表2）；对关节软骨细胞、表层及深层的病理改变分别进行积分比较，只有关节软骨表层病理积分值比较后差异有显著性（P<0.05），软骨深层病理改变及细胞改变差异无显著性（P>0.05）（附表3～5）。

2.2模型复制后第9周两组观察结果比较

2.2.1模型复制后第9周大体观察关节软骨及关节液变化的比较：对照组软骨改变进一步加重，失去原有的光泽，呈灰黄色，表面尚光滑；关节液明显增多，色浅黄，浑浊，关节液内混有少许絮状物，粘度差，无拉丝现象。SH治疗组关节液透明，略浑浊，拉丝良好。软骨呈浅黄色，软骨表面光滑，表面仍有光泽。

2.2.2模型复制后第9周光镜病理观察结果比较：对照组软骨病理观察其表面变得粗糙，有明显缺损，糜烂或溃烂广泛形成；深层裂纹明显，软骨触之变软，可见边缘有细小骨赘形成，局部少见软骨下囊肿形成；细胞成簇明显，软骨细胞显著缺失（附图3）。SH治疗组软骨表面局部细小缺损，表面尚有光泽；深层可见细小裂纹形成，但未见骨赘及软骨下囊肿形成；细胞也成簇存在，软骨细胞缺失（附图4）。

模型复制后第9周两组关节软骨病理总积分比较差异有显著性（P<0.01）（附表2）；两组对关节软骨细胞、表层及深层的病理改变分别进行积分比较后差异均有显著性（P<0.05）（附表3~5）。

2.3模型复制后第13周两组观察结果比较

2.3.1模型复制后第13周大体观察关节软骨及关节液变化的比较：对照组软骨改变严重，关节面失去光泽，表面粗糙，暗淡；关节液增多，不透明，浑浊，内可见混有大量絮状物，粘度差。SH治疗组关节面光滑，尚有部分光泽，灰黄色；关节液透明，略浑浊，拉丝良好。

2.3.2模型复制后第13周光镜病理观察结果比较：对照组软骨病理观察软骨表面形成溃疡，大小、形态及深浅不一，深者可达骨质，局部有软骨下骨板暴露。裸露骨质可见磨损样改变（附图5）。SH治疗组软骨表面呈浅黄色，表面粗糙，可见细小裂纹和细小溃疡形成。软骨表面溃疡周边有翳状增生现象。未见软骨下骨裸露，关节周边无骨赘形成（附图6）。

两组关节软骨病理总积分比较差异有显著性（P<0.01）（附表2）；两组对关节软骨细胞、表层及深层的病理改变分别进行积分比较后差异均有显著性（P<0.05或P<0.01）（附表3~5）。

3 讨论

目前我国进入人口老龄化阶段，老年退行性疾病发病比例明显增高，而以膝关节畸形、疼痛为代表症状的膝关节骨性关节炎在中老年人群中患病率较高。在欧美、日本应用SH治疗膝关节骨性关节炎以后^[9-10]，国内应用SH治疗各型骨性关节炎的研究报道也逐年增多，但大家多集中在临床疗效的报道上，单纯应用SH干扰骨性关节炎的病理发生发展过程的基础性研究国内报道尚少^[11]。本实验进行动物模型复制后，通过观察关节内注射透明质酸钠后的病理变化，为临床提供透明质酸干扰膝关节骨性关节炎病变进程的病理学基础。

关节软骨的变化：通过对模型复制后第5、9、13周的关节软骨进行大体观察和组织病理学观察，发现其主要的变化与文献报道符合。在形态学上，关节软骨的退行性改变及破坏是其基本病变，本实验第5周对照组的病理变化与此相符。随着胶原退化的进一步发展，胶原退化在关节损害的边缘和临近的细胞间质更加明显，符合本实验第9周对照组的主要病理变化。最后，磨损最大的关节面上的软骨被擦去，使软骨下骨显露。由于不断摩擦，骨面变得很光滑，呈象牙样骨，磨损较小的外围软骨面出现增殖和肥厚。而本实验第13周对照组的主要病理变化就是出现软骨下骨板暴露，但因实验时间短，尚未广泛出现骨赘及骨板暴露。在细胞水平，软骨中虽然软骨细胞很少只占１％，但其生存或死亡在骨性关节炎关节软骨中起重要作用。骨性关节炎中正常软骨及非负重区软骨中的软骨细胞数少于正常关节软骨中的软骨细胞数。随骨性关节炎的严重程度增加，退化的软骨细胞数增多，光镜下软骨细胞数减少，排列紊乱并有成簇现象，可见到细胞核固缩，呈浓密深染状态。关节软骨细胞退行性改变早期表现为细胞外形正常，核膜清晰；中期，细胞周晕消失，胞核致密，外形不规则，核膜不清，其中细胞周晕消失是软骨细胞退行性改变的重要标志，晚期表现为细胞的电子密度明显增加，胞核胞质结构无法辨认^[12-14]。本实验中，随着膝关节炎的进展，软骨细胞的数量逐渐减少，符合本病的特点。

关节液的病理变化：在骨性关节炎的发展进程中，随着关节软骨的破坏，大量炎性物质、磨损后产生的坏死物质进入关节腔内，刺激滑膜，从而使滑膜分泌的液体增多，分泌液中的胶原成分随之减少，关节液的性状改变使关节液的PH值由弱碱性转为弱酸性；色泽由澄清变为浑浊，内混有絮状物；关节液粘度亦随着病程的进展而进一步降低，最后关节液拉丝现象消失^[15-17]。本实验中，在复制模型的第五周我们即发现关节液变为浑浊，拉丝现象减弱，说明粘度降低，随着病变的进展，关节液浑浊程度加重，并出现絮状物，最后拉丝现象消失。

本实验结果显示，SH治疗组的关节软骨病理改变总积分在模型复制后第5、9、13周均明显低于对照组，并有显著性的差异，说明透明质酸钠对兔膝骨关节炎的疗效确切。同时也观察到，随着时间的推进，各期之间的病理积分也在向前发展，说明不论是对照组还是治疗组，关节软骨的病理改变是不断持续进展的。而有所不同的是SH治疗组在模型第五周即开始对家兔膝骨关节炎的病理改变进行影响。在第5周时，因关节软骨的主要病理改变只局限在表层，所以SH的作用也主要作用于对软骨表层病理变化的改善作用，及所观察到的SH可改善膝骨关节炎中的关节液性状，消除软骨表层出现的糜烂及脆裂。但因而深层及细胞水平的病理改变并未明显出现，所以SH对这两者的作用不明显。随着病变的进展，对照组的病变逐渐加重，但在SH治疗组，因已有SH对病变的关节软骨进行屏障保护及治疗作用，所以在后期病理改变继续发展的过程中，SH治疗组的病理改变与对照组的病理改变比较均有显著性差异，大体观察及光镜观察其病理变化程度也明显轻于对照组，在模型复制后第13周，SH治疗组尚未见到明显的软骨下骨板暴露，未见明显的骨赘形成，充分证明SH能延缓关节软骨的病理变化。另外，SH还可以改善关节润滑情况，保持关节液的性状和粘度，从而直接营养关节软骨，延缓关节软骨的破坏进程^[18-19]。

本实验成功复制了膝关节骨性关节炎的模型，对其关节液及关节软骨的病理学变化有了更深的认识，并发现外源性给与SH可大大地缓解膝关节炎的病变过程，为临床上合理应用SH治疗膝关节骨性关节炎提供一定的实验室依据。

 

参考文献

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附    图

 

Fig.1  5w pathological changes of              Fig.2  5w pathological changes of             cartilage in control group                      cartilage in SH group      

 

Fig.3  9w pathological changes of              Fig.4  9w pathological changes of          cartilage in control group                       cartilage in SH group      

 

Fig.5  13w pathological changes of           Fig.6  13w pathological changes of        cartilage in control group                     cartilage in SH group      

 

附  表

Table1 Reasonable standard of evaluation parameters articular cartilage

关节软骨异常	评分
	+1	+2	+3	+4
表层缺损	轻微	中等	局限性严重	广泛性严重
糜烂或溃烂	可看到	中等	局限性严重	广泛性严重
表面脆裂	可看到	中等	显著	广泛
裂纹（V形裂口）	1个十分小的	1个小的	2个小的或1个中等	3个小的、2个中等或1个大的
软骨下囊肿	1个十分小的	1个小的	2个小的或1个大的	3个小的或2个大的
骨赘	十分小	小	中等	大
软骨下骨暴露	局限性	中度	广泛	非常广泛
细胞成簇	3—4个小的或1—2个中等	5—6个小的或3—4个中等或1—2个大的	7个或更多个小的或5—6个中的或3—4个大的	7个或更多中的或5—6个大的
软骨细胞缺失	可观察到	中度	显著	非常广泛

　   其中成簇一项：小的细胞成簇为2～4个软骨细胞，中度的细胞成簇为5～8个软骨

细胞，大的细胞成簇为9个或更多软骨细胞。

Table 2 Changes in articular cartilage in each group manager of the comparative total points（x±s）

组别	n		时相
		5W	9W	13W
对照组	18	12.50±0.70	23.55±3.45	25.87±1.41
SH治疗组	18	8.70±2.10﹡	13.05±1.83﹡﹡	16.60±1.09﹡﹡

注：与对照组比较，﹡P＜0.05 ﹡﹡P＜0.01；

Table 3  Pathological changes in chondrocytes in each group compared integral means（x±s）

组别	n		时相
		5W	9W	13W
对照组	18	4.01±0.79	6.02±1.32	7.57±1.62
SH治疗组	18	3.10±0.19	4.61±1.06﹡	5.08±2.09﹡

注：与对照组比较，﹡P＜0.05 ﹡﹡P＜0.01；

Table 4  Pathological changes of the cartilage surface of each group compared integral means （x±s）

组别	n		时相
		5W	9W	13W
对照组	18	6.12±1.83	8.07±1.78	9.98±2.12
SH治疗组	18	4.07±1.21﹡	5.04±1.65﹡	5.11±1.39﹡﹡

注：与对照组比较，﹡P＜0.05 ﹡﹡P＜0.01；

 

Table 5  Underlying pathological changes of cartilage in each group compared integral means （x±s）

组别	n		时相
		5W	9W	13W
对照组	18	1.98±0.23	8.41±2.18	9.28±1.72
SH治疗组	18	1.57±0.92	5.60±1.05﹡	6.07±1.99﹡

注：与对照组比较，﹡P＜0.05 ﹡﹡P＜0.01