韩飞，毛毅敏

河南科技大学第一附属医院呼吸内科，河南洛阳 471003  

【摘要】 目的：探讨茎叶人参皂甙对内毒素( LPS) 性肺损伤的保护作用机制。方法：SD大鼠30只，随机分为正常对照组（n=10）、内毒素损伤组（n=10）、茎叶人参皂甙组（n=10），经尾静脉注射内毒素建立急性肺损伤模型,腹腔内注射茎叶人参皂甙进行干预。观查肺系数、肺湿/干重量比(W/ D) 、肺组织病理学检查改变、肺组织蛋白、血小板活化因子(PAF)、白介素-1β(IL-1β) 等含量的变化。结果：与正常对照组相比，损伤组肺W/D、肺系数升高、病理学检查肺组织损伤明显、肺组织蛋白、PAF、IL-1β含量明显升高（P<0.01）；皂甙组与内毒素损伤组相比肺W/D肺系数较低、病理学检查肺组织损伤较轻，肺组织蛋白、PAF、IL-1β含量下降明显（P<0.01）。结论：茎叶人参皂甙可以通过抑制PAF和 IL-β的水平而减轻内毒素所致的肺损伤。

【关键词】血小板活化因子；白介素-1β；内毒素；肺损伤；茎叶人参皂甙

Protective effect of Stem and Leaf Ginsenoside on lipopolysaccharide induced acute lung injury

Han Fei，  Mao Yi-min， 

First Affiliated Hospital,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China

【Abstract】Objective: To study the preventive effects of Stem and Leaf Gnsenoside on lipopolysaccharide induced acute lung injury of rats  Methods: 30 SD rats were randomly divided into：normal group (n=10)，LPS  group(n=10)，GS group(n=10)。The ALI model was set up by intravanously injection of lipopolysaccharide (LPS, 5 mg/ kg) . Intra-abdominal injected Stem and Leaf Ginsenoside for  intervention .Observe the change of lung coefficient 、the lung rate of wet weights to dry weights of this rat(W/ D). Pulmonary histopathological examination by visual inspection and×200 microscope、content of protein、PAF and IL-1βof lung tissue  Results: LPS group’s pulmonary histopathological examination were worse damaged、 lung coefficient、W/D、content of protein、PAF and IL-1βof lung tissue were much higher than the other two groups（P<0.01），Compare with LPS group pulmonary histopathological examination were lighter damaged、and lung coefficient、W/D、content of protein、PAF and IL-1βof lung tissue of GS group were much higher（P<0.01） Conclusion:Stem and Leaf Ginsenoside can partly inhibit PAF andIL-1β levels of the ALI lung tissue in rat model with lipopolysaccharide-induced acute lung injury treatment, have a preventive effect against rat ALI.

【key words】Platelet-Activating Factor ；Interleukin-1β；lipopolysaccharide； acute lung injury；Stem and leaf Gnsenoside　

急性肺损伤（Acute lung injury，ALI）是由多种损伤原因造成的肺损害，既是呼吸道重大疫病(如SARS、禽流感、甲流)的病理基础,也是全身炎症反应综合征( systemic

基金项目:河南省科技厅科技攻关课题(项目编号:072102330029)

﹡作者简介：韩飞 河南省上蔡县人 住院医师，在读硕士研究生。研究方向：呼吸内科疾病基础及临床研究  河南科技大学第一附属医院呼吸内科，河南洛阳 471003  联系方式：13698849371  Emai:l hanfei200807340@ 163·com

﹡通讯作者：毛毅敏 河南洛阳人 医学博士，教授、主任医师、硕士研究生导师、呼吸内科主任 联系方式：0379-64830489、13937968696

inflammatory response syndrome, SIRS)时最易出现的组织损伤^{[ 1 ]} 。ALI 的严重阶段则是急性呼吸窘迫综合症（Acute respiratory distress syndrome，ARDS）。随着失控性的炎症反应( uncontrolled inflammatory response)引发多器官功能障碍综合征(multipile organs disfunction syndrome,MODS)学说的提出,人们对AL I/ARDS认识转向对炎症发生、调控的认识,参与炎症反应的炎症细胞和细胞因子则成为研究的热点 。内毒素是导致ALI的重要因素之一,已有大量实验表明,炎症介质在内毒素肺损伤的发病中起重要作用^[2]。ALI 的发病机制复杂，炎症反应在ALI/ARDS中起到核心作用，其发病机制尚未完全阐明^[3]。近年来有研究证明，血小板激活因子（Platelet activating factor，PAF）及白细胞介素- （Inter leukin- 1β，IL- 1β）在ALI 的作用比较突出^[4]，本实验通过复制大鼠内毒素性ALI模型,观察茎叶人参皂甙对肺组织炎症介质PAF和IL-1β水平的影响揭示其对急性肺损伤的保护作用。

1. 材料与方法

1.1材料

1.1.1 实验动物  清洁级成年SD大鼠30只，雌雄不拘，体重（230 ±20) g，由河南省实验动物中心提供。

1.1.2 药物与试剂  内毒素脂多糖（LPS,L2880美国Sigma公司产品)，茎叶人参皂甙干粉（吉林抚松大自然生物工程有限公司），大鼠PAF 和IL-βElisa试剂盒（美国RD公司产品)，BCA蛋白定量试剂盒（北京博迈德科技发展有限公司)

1.1.3 主要实验仪器  AL104电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司), BX61光学显微镜及照相系统(日本OLYMPUS公司), 血气分析仪(德国Bayer公司), ALISEI.Q.S型全自动酶标仪(意大利SEAC)，全自动生化分析仪(日本日立公司)，DY89-1型电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组：清洁级成年SD大鼠30只，随机分为：正常对照组、内毒素损伤组、茎叶人参皂甙组，每组10只。

1.2.2 动物模型的制备：实验前大鼠禁食12小时，自由饮水。实验开始前2小时称重大鼠，皂甙组先腹腔内注射90%茎叶人参皂甙干粉溶液100 mg﹒kg^-1﹒ml^-1，实验开始后内毒素组和皂甙组均尾静脉注射LPS 5mg﹒kg^-1﹒ml^-1。

1.2.3 检测指标及方法：　5小时后各组动物用3.5%戊巴比妥钠(35 mg﹒kg^-1﹒ml^-1)腹腔内注射麻醉, 腹主动脉抽血(1：500肝素抗凝)0.5ml测动脉血气，1小时后腹主动脉采血处死大鼠，动脉血样(1：500肝素抗凝) 以4 ℃ 3000 r/min 进行低温离心20 min,取上清液,分装到EP管内，- 20 ℃冰箱保存备用。开胸取全肺称重计算肺系数，取左肺电子天平称湿重后置于烤箱中110℃，24h焙干，称干重，计算肺湿/干重比，取右肺下叶置于10%福尔马林液中固定12小时后石蜡包埋切片HE染色作显微镜病理学检查。取称重后的肺组织按照100mg组织加1 mlPBS缓冲液进行冰浴匀浆,充分匀浆后转移到预冷的4 ℃ EP管中。以4 ℃3000 r/min 进行低温离心20min,取上清液装入新的EP管内,- 20 ℃冰箱保存备用。BCA蛋白定量试剂盒检测肺组织匀浆中蛋白含量，Elisa法测血浆和肺组织匀浆中PAF和IL-β含量。采用双抗体夹心ELISA法按试剂盒要求测定,用酶标仪分别在波长450 nm 和492 nm 处测定其OD值,应用ELISA分析软件计算其含量。

1.2.4 统计学处理：采用SPSS17.0统计软件进行数据处理，定量资料数据以均数±s标准差(±s)表示。采用单因素方差分析进行多组比较，组间两两比较采用SNK-q检验。（P<0.05）为差异有统计学意义。

2．结果

2.1肺组织病理学变化：大体观察正常对照组肺组织表面包膜光滑，呈淡粉红色，无充血水肿情况；损伤组肺组织体积增大色泽暗红，充血水肿明显，可见包膜下点片状瘀血和出血点及散在梗死灶；皂甙组肺组织充血水肿较轻，可见少量散在出血点，未见梗死灶。HE染色200倍光镜下观察，正常组肺组织结构清晰，肺间质无充血，肺泡内无渗出，仅见少量炎性细胞；内毒素组可见肺微血管充血、出血及微血栓形成，肺间质和肺泡内渗出明显，可见大量炎症细胞浸润，肺泡间隔增厚，局灶肺不张；皂甙组病理学改变近似，可见肺微血管充血、出血、炎症细胞浸润等，但比损伤组较轻，未见肺不张病灶。见图（1～3）

图1正常组（×200）          图2皂甙组（×200）         图3损伤组（×200）

2.5 各组大鼠肺W/D比值、肺系数和肺组织匀浆蛋白含量比较：见表1

表1 茎叶人参皂甙对LPS致ALI大鼠肺系数、肺W/D比值和

肺组织匀浆蛋白含量的影响（±s）

Tab.1  Effect of stem and leaf of ginsenoside on Arteries lung coefficient 、lung W/D and content of homogenate of lung tissue in LPS induce ALI rats（±s）

^▼与对照组对比（P<0.01），^△与损伤组对比（P<0.01）,

大鼠肺系数、肺W/D比值和肺组织匀浆蛋白含量三组间比较存在统计学差异（P<0.01）

（F和P分别为：F=5.32 P=0.000；F=23.02 P=0.000；F=8.30 P=0.000），皂甙组与损

伤组比较也存在统计学差异（P<0.01）。

2.6 各组大鼠血浆和肺组织匀浆PAF、IL-β含量比较:见表2

   表2茎叶人参皂甙对LPS致ALI大鼠血浆和肺组织IL-β和PAF含量的影响（±s）

Tab.2  Effect of stem and leaf of ginsenoside on the level of IL-1βand PAF of lung tissue and plasma in LPS induce ALI rats（±s）

^▼与对照组对比（P<0.01）， ^△与损伤组对比P＜0.01

大鼠血浆PAF、IL-β和肺组织匀浆PAF、IL-β三组间比较存在统计学差异（P<0.01）（F和P分别为：F=303.30 P=0.000； F=62.64 P=0.000；F=122.76 P=0.000；F=15.14 P=0.000），其中匀浆中含量明显高于血浆。皂甙组与损伤组比较也存在统计学差异（P<0.01）。

3.讨论

      ALI/ARDS 是肺组织对严重感染、创伤、休克及大量输血、输液等打击后产生广泛而过渡的炎症反应, 以肺泡毛细血管膜损伤为基础,渗透性肺水肿和肺不张为特征,临床表现为急性呼吸窘迫和顽固性低氧血症的综合征。其发病机制复杂目前尚无特效治疗药物。内毒素是强有力的致伤剂，也是导致ALI的重要因素^〔2〕。有人通过大鼠静脉注射内毒素致肺损伤实验证实,经大鼠静脉注射内毒素5mg/kg 可造成肺损伤。本实验结果也证实,内毒素可引起大鼠肺水肿、出血、炎性细胞浸润、肺泡结构破坏、W/D比值增高等病理表现;这些均提示ALI 的存在。 Doebber和李少华等观察到大鼠静脉注射内毒素后血中PAF和IL-1β等炎症介质水平升高^〔2〕。本实验结果也证实LPS性肺损伤时血中IL-1β和PAF水平会显著升高。

ALI是全身炎症反应综合征( systemic inflammatory response syndrome, SIRS)在肺部的表现,内毒素或脂多糖(lipopolysaccharide , LPS) 引起的SIRS在ALI/ ARDS的发生发展中起关键作用。内毒素诱导使多种炎性细胞激活, 大量致炎细胞因子释放(包括TNF - α、IL - 1β、IL - 6、IL - 8、血小板活化因子( PAF)等)，同时激活更多的炎性细胞,释放更多的炎性介质或细胞因子,使机体损害信号进一步放大和加强,形成炎症瀑布效应，引发体内过度或失控性炎性反应。大量促炎因子之间形成复杂的细胞因子网络,互相激活、互相作用,使炎症反应级联放大。在炎性反应的发生发展过程中, IL - 1β发挥着重要作用， TNF - α是始动因素, TNF - α是强有力的炎性介质作用于中性粒细胞使其发生“呼吸爆发”,产生大量氧自由基,IL - 1β则起到协同作用^{[ 5 -6 ]} 。PAF 也是参与内毒素性肺损伤的重要介质，亦是一种强效的炎性介质和趋化因子，其可直接或间接损伤肺血管内皮细胞,导致其通透性增加。PA F 能够激活“扣押”在肺循环里的中性粒细胞, 同时中性粒细胞激活又可产生、释放PA F。其与内毒素的协同作用促使TNF - α的产生,加重肺损伤^[7]。有研究提示: PAF 可能是肺损伤的启动因子。有研究证实直接往大鼠气管内滴注PAF，可产生ALI的病理变化^[8]，PAF抑制剂可以阻止PAF引起的ALI样变化^[9]。本实验研究发现内毒素性肺损伤时大鼠血浆及肺组织中IL-1β和PAF水平均升高，且肺组织水平高于血浆，也说明炎症介质在肺内聚集加重了肺损伤。茎叶人参皂甙能抑制血浆中炎症介质IL-1β和PAF水平，尤其能显著抑制其在肺内的聚集，推测可能与其的保护作用机制有关。

目前中药防治内毒素性休克的机制研究,主要集中在直接破坏内毒素、抗炎、抗自由基、改善微循环、防治弥散性血管内凝血、激活网状内皮系统、保护细胞器等方面^{〔10 -12〕}，探讨中药防治内毒素性休克的作用机制,可能对中药研究和内毒素性休克的防治具有重要价值。本研究从炎症介质角度观察到LPS致大鼠急性肺损伤模型中,茎叶人参皂甙可抑制血浆及肺组织中IL-1β和PAF的水平的升高,提示有助于缓解炎症反应,但急性呼吸窘迫综合征可由多种原因引起,发病机制错综复杂,各种生物信号分子的作用互相交织,成一网络,仍未完全明了,因此治疗也相当棘手。此外,由于本研究实验动物数量有限，且从动物实验到临床应用尚有很大的距离,因此需要开展多中心、随机、双盲、安慰剂—对照的临床实验,以评价茎叶人参皂甙对急性肺损伤的保护作用。

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