大豆异黄酮的抗氧化和抗肿瘤活性研究*

所属分类：医学论文  日期：2018-09-04  浏览：次

徐春华，张治广²，谢明杰³

（1.大连职业技术学院电气与电子工程技术系，辽宁 大连，116037；2.辽宁师范大学化学化工学院，辽宁大连，116029；3.辽宁师范大学生命科学学院，辽宁大连，116029）

 

【摘要】  目的：研究大豆异黄酮的生理活性。方法：采用邻苯三酚自氧化法和Fenton法，检测大豆异黄酮的抗超氧自由基和羟基自由基的活性，MTT比色法检测大豆异黄酮对大鼠肝癌CBRH-7919细胞和小鼠白血病CML-K562细胞增殖的影响来研究大豆异黄酮的抗氧化和抗肿瘤活性。结果：表明大豆异黄酮具有显著的抗氧化和抗肿瘤活性。其中大豆异黄酮对超氧自由基的清除率达到50%时所需要的用量（IC₅₀）为0.14mg·mL^-1；对羟基自由基的清除率达到50%时所需要的用量（IC₅₀）为0.57mg·mL^-1；大豆异黄酮对CBRH-7919细胞生长抑制率达到50%时所需要的用量（IC₅₀）为 7.55mg·L^-1；对CML-K562细胞生长抑制率达到50%时所需要的用量（IC₅₀）为10.35mg·L^-1。大豆异黄酮具有显著的抗氧化和抗肿瘤活性。

 

关键词：大豆异黄酮，抗氧化活性，抗肿瘤活性

中图分类号：       文献标识码：         文章编号：

Research on antioxygenic and antitumor activities of Soybean isoflavones

XU Chun-hua¹,ZHANG Zhing-guang², XIE Ming-jie³

(1. Electrical and electronic engineering technology department, Dalian Vocational and Technical College, Liaoning Dalian,116037；2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Liaoning Normal University, Dalian, Liaoning 116029；3. The College of Life Science, Liaoning Normal University, Liaoning Dalian 116029)

Abstract: Object: Study the physiology activity of the soybean isoflavone. Methods:To investigate the bioligical activities of Soybean isoflavones. Pyrogallol autoxidation method and Fenton method were used to detect that whether soybean isoflavones could scaverge hydroxyl free radical and superoxide free radical. MTT assay was used to examine the effect of Soybean isoflavones on cell viability. Results: The results showed that Soybean isoflavones exhibits antioxygenic activity,the antitumor activity and antibacterial activity.50% elimination concentration of soybean isoflavones on superoxide free radical and hydroxyl free radical is 0.14 mg·mL^-1 and 0.57 mg·mL^-1.Soybean isoflavones can inhibit CBRH-7919 cell and CML- K562 cell growth in a dose-depent manner. 50% inhibitory concentration(IC₅₀) on CBRH-7919 cell is 7.55 mg·L^-1，And IC₅₀ on CML- K562 cell is 10.35 mg·L^-1. Soybean isoflavones exhibits antioxygenic activity,the antitumor activity and antibacterial activity.

 

Keywords：Soybean isoflavone, antioxidant activity, antitumor activity

 

最新人口普查表明，现在我国60岁以上的老年人口有约1.3亿，我国已经提前步入老龄化社会。到2050年老年人将达到4.39亿，占总人口的1/4。早在1955年，Dr.Harman发表的“衰老的自由基理论”就提出，体内产生过多自由基是引起衰老的重要因素，而且自由基过多还可导致癌症的发生，因此保持体内自由基和抗氧化剂的平衡可以延缓衰老和预防癌症。大豆异黄酮(Soybean isoflavone)是一类从大豆中分离提取出的具有多酚结构混合物的统称，主要是指以3-苯并吡喃酮为母核的化合物，是大豆生长过程中的一种次级代谢产物，主要分布于大豆种子的子叶和胚轴中。目前的研究表明，大豆异黄酮具有对血管的防护作用、类似女性雌激素作用以及抗激素作用、抑菌活性和预防骨质疏松症等^[1-3] 多种生理功能，最近还有研究证实它可能被作为一种天然抗氧化剂。而许多天然的抗氧化剂都具有抗肿瘤功效^[4]。因此本文对大豆异黄酮的抗氧化和抗肿瘤活性进行了研究，旨在将其进一步开发为高效、无毒副作用的新型抗氧化剂和抗肿瘤药物提供理论依据。

 

1 材料与方法

1.1 供试材料

大豆异黄酮：购于大连绿峰食品有限公司（纯度为80%）  

小鼠红白血病CML-K562细胞株和大鼠肝癌CBRH-7919细胞株，由辽宁师范大学分子生物学实验室惠赠。四甲基偶氮唑蓝（MTT）为美国Sigma公司产品。RPMI1640培养基购自美国Gibco公司。供试菌株购于中国医学菌种保藏中心。实验所用试剂均为分析纯，购于化学试剂公司。

1.2试验方法

1.2.1样品溶液的配制

称取0.05g的大豆异黄酮溶解于无水乙醇中定容至25mL，使其终浓度为2 mg·mL^-1。

1.2.2大豆异黄酮对超氧自由基抑制率的测定

取10mL比色管数支^[5-7]，各加入2mL pH8.3 Tir-HCl缓冲液，然后分别加入不同体积的大豆异黄酮样液，使其终浓度分别为0.05、0.1、0.15、0.2 mg·mL^-1，再加入0.6mL 0.002 mol·L^-1的邻苯三酚，然后定容至10mL，混匀后立即在318.8nm下记录0-3min内反应液的吸光值，并按照下列公式计算抑制率，以不加样品液作为对照。

抑制率（%）=（v₀-v）/v₀×100%

V₀：对照组邻苯三酚自氧化时的反应速率，V：加药后邻苯三酚自氧化反应速率。

1.2.3大豆异黄酮对羟基自由基清除率的测定

在10mL刻度具塞试管中加入不同体积的大豆异黄酮样液^[8，9]，使其终浓度分别为0.5、1、1.5、2和2.5 mg·mL^-1，然后加入 2mL 200 mmol·L^-1的DMSO，1mL 0.1 mol·L^-1 HCl，2.5mL 18 mmol·L^-1 FeSO₄，3mL 80 mmol·L^-1H₂O₂，用去离子水补齐至刻度后混匀。取上述混合液，加入2mL 15 mmol·L^-1坚牢蓝BB盐，室温反应10min。加入 1mL吡啶使颜色稳定，然后加3mL甲苯：正丁醇（3：1）混合液，充分混匀后静置分层。移弃下层相中未反应的偶氮盐，上层相用5mL经正丁醇饱和的水冲洗，取上清液于420nm下测定其吸光度并按照下列公式计算清除率。

清除率=(A₀-A_S)/A₀× 100%

A_S：加药后测定的吸光度， A₀：不加药测定的吸光度。

1.2.4MTT比色法检测CML-K562细胞和CBRH-7919细胞活力

    取对数生长期细胞，稀释至1×10⁴个/mL的细胞悬液，以每孔200μL接种于96孔板，培养24h后，实验组分别加入0.25，1.25，5.0，7.5，10，15，20，25，30和40 mg·L^-1的大豆异黄酮，对照组加入30%的乙醇溶液，每个浓度设6个平行孔。继续培养4d后，每孔加入浓度为5 mg·mL^-1的MTT 20μL，37℃培养4h，弃去培养液，加入150μL DMSO，轻微振荡溶解结晶，用酶标仪在490nm处测吸光度（A）值，计算细胞生长抑制率和大豆异黄酮对肿瘤细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）^[10，11]。实验重复三次，取平均值分析。

细胞生长抑制率（%）=（1-给药组吸光度/对照组吸光度）× 100%

半数抑制浓度(IC₅₀)的计算：应用多功能半数致死量软件（SUN YAT-SEN University of Medical Sciences, version 2.1）Bliss法计算。      

1.2.7 统计学分析 相关数据用均数±标准差表示，数据采用SPSS16.0软件进行差异显著性 t 检验。

 

2结果与分析

2.1大豆异黄酮的抗氧化活性

2.1.1大豆异黄酮对超氧自由基的抑制作用

不同浓度的大豆异黄酮按照方法1.2.2反应得到的光谱动力学曲线见图1。根据光谱动力学曲线由抑制率对浓度作图绘制的抑制率曲线见图2。由图2可知，大豆异黄酮对超氧自由基的抑制作用具有浓度依赖关系，随着大豆异黄酮浓度的升高，其抑制率也随着增大。其中，当抑制率达到50%时所需要的大豆异黄酮的浓度即IC₅₀为0.14 mg·mL^-1。

 

          图1 光谱动力学曲线

           Fig.1 Spectral dynamics curves

 

 

 

 

 

 

 

 

           图2大豆异黄酮对超氧自由基的抑制作用

           Fig.2 Inhibition of soybean isoflavones on hydroxyl free radical

 

2.1.2大豆异黄酮对羟基自由基的清除作用
    不同浓度的大豆异黄酮对羟基自由基的清除率曲线见图3。由图可知，大豆异黄酮对羟基自由基的清除作用具有浓度依赖关系，随着浓度的升高，大豆异黄酮对羟基自由基的清除率也随着增大。其中当清除率达到50%时所需要大豆异黄铜的浓度（IC₅₀）为0.57 mg·mL^-1。

图3大豆异黄酮对羟基自由基的清除作用

   Fig.3 Elimination of soybean isoflavones on superoxide free radical

 

2.2大豆异黄酮的抗肿瘤作用

2.2.1 大豆异黄酮对大鼠肝癌细胞CBRH-7919的抑制作用

    大豆异黄酮对大鼠肝癌细胞CBRH-7919的抑制作用结果见图4。由图可知，不同浓度大豆异黄酮对大鼠肝癌CBRH-7919细胞系有生长抑制作用，抑制率具有浓度依赖关系。当大豆异黄酮的浓度为1.25、2.5、5.0、10、15和20 mg·L^-1时，细胞生长抑制率分别为（18.75±0.08）%、（33.50±0.10）%、（41.29±0.12）%、（53.76±0.13）%、（55.93±0.12）%和（54.44±0.11）%。当大豆异黄酮的浓度增加到15 mg·L^-1时抑制率基本趋于平缓，提示此时细胞大部分已死亡。其半数抑制浓度（IC₅₀）为7.55ｍg·Ｌ^-1。

2.2.2大豆异黄酮对小鼠白血病细胞CML-K562的抑制作用

大豆异黄酮对小鼠白血病细胞CML-K562的抑制作用结果见图5。由图可知，大豆异黄酮对小鼠白血病 CML-K562细胞有一定的生长抑制作用，并且随着大豆异黄酮浓度的增加，抑制作用也增强。当大豆异黄酮的浓度为1.25、2.5、5.0、10 、15和20 mg·L^-1时，细胞生长抑制率分别为（23.78±0.06）%、（31.38±0.08）%、（37.30 ±0.05）%、（45.18±0.06）%、（57.83±0.07）%和（60.04±0.01）%。当大豆异黄酮的浓度增加到20 mg·L^-1时抑制率基本趋于平缓，可见此时细胞大部分已死亡。其半数抑制浓度（IC₅₀）为10.35 mg·L^-1。                                    

 

图4大豆异黄酮对CBRH-7919细胞的生长抑制作用   图5大豆异黄酮对CML-K562细胞的生长抑制作用

Fig.4  Inhibition of soybean isoflavone             Fig.5  Inhibition of soybean isoflavone

on CBRH-7919 cell growth                         on CML- K562 cell growth

 

3 结论与讨论

众所周知，自由基是导致多种疾病，催动老化的罪魁祸首。医学研究证实，人体在新陈代谢过程中会产生自由基，若自由基过多，体内抗氧化物质又不足以抑制时，就对人体起破坏作用，很容易诱发多种疾病，也是外表机体衰老的基本原因。因此，消除自由基，增强抗氧化能力，便成为祛病健体，延缓衰老的重要对策。近年来的研究已发现天然食材来源的黄酮类化合物包括槲皮素、木犀草素、大豆异黄酮等都是优良的自由基清除剂和良好的天然抗氧化剂^[12,13]。因此本实验对大豆异黄酮的抗氧化活性进行了研究，结果显示，大豆异黄酮对超氧自由基和羟基自由基的清除作用具有浓度依赖关系，随着大豆异黄酮浓度的升高，对超氧自由基和羟基自由基的清除率也随着增大。其中，大豆异黄酮清除超氧自由基的IC₅₀ 为0.14 mg·mL^-1，清除羟基自由基的IC₅₀ 为0.57 mg·mL^-1。有研究认为大豆异黄酮的抗氧化作用主要是因为大豆异黄酮的结构中含有酚羟基，这些酚羟基作为供氧体能够与自由基反应使之生成相应的离子或分子，猝灭了自由基，终止了自由基的连锁反应，但具体的机制还有待进一步的研究。

由于自由基产生过多或清除过慢时，它可通过氧化攻击生命大分子物质，使身体的细胞、组织器官受损，加重身体的衰老过程，并诱发各种疾病，尤其是可诱发癌症。因此清除自由基也可以有效地预防癌症的发生，研究表明，多种黄酮类化合物都可通过其抗氧化活性来实现它的抗肿瘤作用。因此本实验又进一步研究了大豆异黄酮的抗肿瘤活性，结果表明大豆异黄酮具有较强的抗肿瘤活性，它能够抑制大鼠肝癌细胞CBRH-7919和小鼠白血病细胞CML-K562的生长，其IC₅₀分别为7.55 mg·L^-1和10.35 mg·L^-1。但其具体机制是否与抗氧化活性有关，还有待更深入的研究。

因此人们在日常生活中可以多摄入一些富含天然抗氧化剂的食物，如大豆，白萝卜、胡萝卜段、牛蒡段、香菇五种蔬菜组成的五色蔬菜汤等来补充足够的抗氧化物质，及时清除体内多余的自由基，这样即可达到延缓衰老和预防肿瘤的双重功效。

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