徐庆

         （南通市第三人民医院肛肠科，江苏 南通 226006）

【摘要】目的：建立简便有效的腹膜间皮细胞体外培养鉴定及TGF-β1、CTGF蛋白含量测定方法。方法：胰蛋白酶-EDTANa₂消化网膜组织培养腹膜间皮细胞；用形态学、免疫组化鉴定细胞。结果 分离培养的细胞符合间皮细胞特征；ELISA法测定细胞培养液中TGF-β1、CTGF蛋白含量简便可行。结论：胰蛋白酶消化法是一种简单实用的分离腹膜间皮细胞的方法；ELISA法测定细胞培养液中TGF-β1、CTGF蛋白含量，可能成为衡量预防术后腹腔粘连药物疗效的客观指标。

【关键词】腹膜；间皮细胞；胰蛋白酶；ELISA法

近年来有关腹腔粘连的发生机理多倾向于炎症学说^[1]。认为各种因素造成腹膜损伤后,导致炎症渗出,产生纤维蛋白粘连。事实上,任何机械损伤、腹膜炎症、组织缺血等病理因素均可引起腹膜的损伤,使腹膜的纤维蛋白溶解酶活性降低,导致大量的纤维蛋白沉积于腹腔器官及腹膜壁层表面而形成网状结构,最终形成永久的纤维结缔组织性粘连。纤维蛋白沉积和降解之间是否平衡是伤口粘连形成的决定因素^[2]。正常的腹腔间皮细胞具有纤溶活性，有多种生长因子和细胞因子参与调控纤维蛋白沉积和降解之间的平衡，其中转化生长因子（TGF）β1、结缔组织生长因子（CTGF）与粘连的形成关系密切。因此，建立腹膜间皮细胞培养体系及TGF-β1、CTGF蛋白含量测定方法,为体外研究腹膜间皮细胞生理功能及其在腹腔粘连防治中的作用提供了有效手段。

目前腹膜间皮细胞培养方法很多,但由于培养所需要的条件苛刻且易受成纤维细胞污染等原因,要获得大量，高纯度的腹膜间皮细胞仍为实验研究中的难题；而现阶段国内对腹膜间皮细胞TGF-β1、CTGF蛋白含量的测定，基本属于空白。笔者综合文献方法并加以改进,建立了腹膜间皮细胞体外培养方法及采用ELISA法测定细胞培养液中TGF-β1、CTGF蛋白含量。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1取材  无菌取自南通市第三人民医院普外科、肛肠科腹部手术切除的大网膜。

1.1.2主要仪器设备  眼科剪、镊，培养皿，培养瓶，吸管，10mL尖底离心管，CO₂培养箱，超净台，离心机，倒置相差显微镜，100目不锈钢筛，0.22µm滤膜过滤器，方盘，6孔板。

1.1.3主要试剂  1640培养液（Invitrogen Corporation公司）使其含有青链霉素各100U/mL，小牛血清20﹪；PBS液；细胞消化液，将胰蛋白酶（国药集团化学试剂公司）2.5g, EDTA二钠盐0.16g溶于1000mLPBS液中，过滤除菌，分装于小瓶内，-20℃保存；免疫组化抗体（波形蛋白抗体，第8因子抗体，CD45抗体，Elivision^TMplus广谱试剂盒）（均为福建迈新公司产品）。

1.2方法

1.2.1 PMC的原代培养  无菌摘取腹部手术切除的大网膜（约3 ×3 cm²），将剪取的网膜组织置于含青、链霉素的无菌生理盐水中浸泡漂洗后，平铺于无菌培养皿内，PBS反复漂洗至没有油珠漂浮，剪除血管及脂肪，将洗净的网膜组织剪碎，加入胰蛋白酶－EDTA细胞消化液20mL，放置于37℃，5％CO₂培养箱内消化25min，每5 min振摇一次，最后5 min保持静止。消化结束后将消化液用100目不锈钢筛过滤于培养皿内，加入等量完全培养液终止消化。分装于10 mL尖底离心管，1000r·min^-1,离心10 min，弃上清，加入适量完全培养液溶解细胞沉淀，分装于50mL培养瓶，放置于培养箱内。

1.2.2 PMC的传代培养  原代细胞培养24h后，以等体积的新鲜完全培养液替换瓶内全部陈旧培养液，此后每3d换液一次。约培养(4～7)d细胞生长融合，可以首次传代。当细胞生长融合成单层，PBS漂洗2次，每瓶加入完全消化液2mL，在培养箱内消化15 min。镜下观察细胞消化情况，细胞脱落变形后，加入4 mL完全培养液终止消化。将细胞悬液分装于离心管内1000 r·min^-1,离心10 min，弃上清，加入适量完全培养液溶解细胞沉淀，分别传代于50 mL培养瓶和含盖玻片的6孔板内，加入适量完全培养液，继续置于培养箱中，培养至细胞完全贴壁伸展。

1.2.3 PMC的鉴定  免疫组化鉴定：细胞爬片取出入10％中性福尔马林固定3；入0.1％TritonX100；滴加即用型一抗，室温下孵育60 min BPS洗3次。每张盖玻片分别滴加50μL Elivision^TMplus广谱试剂盒中的试剂A及试剂B；DAB显色，苏木素复染；脱水；封片。

1.3 ELISA法测定细胞培养液中TGF-β1、CTGF蛋白含量   

采用ELISA法测定细胞上清液中TGF-β1、CTGF蛋白含量。（试剂盒购自福建迈新公司):直接取细胞上清50μL进行测定； 

① 测定前将试剂盒放置室温40min，所有试剂在使用前都轻轻摇匀； 

② 浓缩洗涤液与新鲜的医用双蒸水1：20倍稀释，混匀待用； 

③ 取出酶标板，加入50μL的细胞上清于空白微孔中，先后加入10μL的生物素标记液及50μL的酶标记溶液； 

④用保鲜膜密封酶标板，然后置于37℃的水浴锅中准确水浴60min；

⑤在每个孔中分别加入底物A 50μL底物B 50μL，用移液器反复吸打，进行混匀；

⑥轻微振摇酶标板，然后在37℃水浴锅中避光反应15min；

⑦每个微孔中加入50μL的终止液，用移液器反复吸打，进行混匀；

⑧在Thermo Multiskan Spectrum spectrophotometer酶标仪上，450nm处测定OD。

2结果

光镜下刚从腹膜消化下来的间皮细胞呈分散的小圆型细胞，约24h左右贴壁，个别细胞伸展。72h所有贴壁细胞均伸展，呈梭形等，边缘不整，细胞呈现拉网状生长，与相邻的细胞相互连接。以后细胞拉网生长现象减少，生长融合呈多角形，大小较为一致，似铺路石样外观。免疫组化鉴定，光镜下观察所培养细胞的波形蛋白染色为阳性。ELISA法测定细胞培养液中TGF-β1、CTGF蛋白含量简便可行。

3讨论  

间皮细胞作为一种特殊的上皮细胞，由于其生长环境的特殊性，是上皮细胞中最难培养的细胞之一。目前国内外培养间皮细胞的方法大致有以下几种:①腹水、透析液中分离培养间皮细胞。②以网膜组织或腹膜组织为来源进行的组织块培养法。③以各种组织细胞消化酶如胶原酶、胰酶、EDTA或胰酶+EDTA进行的消化法培养。④用动物的网膜或腹膜进行培养。本实验所建立的腹膜间皮细胞培养模型，方便、易行、廉价、高效、重复性高，为体外研究腹膜间皮细胞生理功能及其在腹腔粘连防治中的作用提供了有效手段。TGF-β1、CTGF等具有调节纤溶酶原激活物的活性作用从而抑制术后腹腔粘连的发生，ELISA法测定细胞培养液中TGF-β1、CTGF蛋白含量，可能成为衡量预防术后腹腔粘连药物疗效的客观指标。

[参考文献]

[1].胡建敏·人体脂肪、alpha-糜蛋白酶联合腹腔灌注预防粘连的实验及临床研究[J]·中华外科实验外科杂志, 1989, 6 (3): 101.

[2].Holmdhl Z, AL-Jabree M, Risberb B. The rok fibrindysis in the formation of past operative adhesions [J]. Wound RepRe, 1994, 7: 17